编译：微科盟索亚，益生应性编辑：微科盟索亚、菌介江舜尧。导色代谢
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导读
2022年3月3日，皮肤皮炎江南大学食品学院陆文伟团队等人在Gut Microbes发表题为《Bifidobacterium longum mediated tryptophan metabolism to improve atopic dermatitis 轴改via the gut-skin axis》的文章。肠道微生物紊乱通过异常的善特免疫反应影响过敏性疾病，包括哮喘、益生应性特应性皮炎(AD)。菌介有研究表明，导色代谢一些双歧杆菌物种和菌株可以通过调节患者的氨酸免疫-微生物相互作用来改善AD。然而，通过双歧杆菌缓解AD的肠道有效代谢物和机制仍有待阐明。本研究旨在探讨长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）的微生物代谢产物及其改善 AD的作用机制。基于鸟枪宏基因组测序和UHPLCQ-Exactive-MS靶向代谢组的体内外试验，我们重点研究了色氨酸代谢和吲哚衍生物，它们是芳香烃受体（AHR）的内源性配体。吲哚-3-甲醛(I3C)是长双歧杆菌CCFM1029（B. longum CCFM1029）的色氨酸代谢物，可激活AHR介导的免疫信号通路，以改善动物和临床试验中的AD症状。长双歧杆菌CCFM1029上调色氨酸代谢并增加I3C以抑制异常Th2型免疫反应，但这些改变被AHR拮抗剂CH223191消除。此外，长双歧杆菌CCFM1029重塑了AD患者的肠道微生物组成，增加了粪便和血清I3C，并维持了与肠道微生物的色氨酸代谢相关的毛螺旋菌科的丰度。结果表明，基于肠道-皮肤轴的相互作用，长双歧杆菌CCFM1029上调色氨酸代谢并产生I3C以激活AHR介导的免疫反应，缓解AD症状。吲哚衍生物（色氨酸的微生物代谢产物）可能是双歧杆菌通过AHR信号通路缓解AD的潜在代谢物。 关键词：长双歧杆菌，色氨酸代谢，肠道-皮肤轴，芳烃受体，吲哚-3-甲醛，特应性皮炎
论文ID
原名：Bifidobacterium longum mediated tryptophan metabolism to improve atopic dermatitis via the gut-skin axis
译名：长双歧杆菌介导色氨酸代谢通过肠-皮轴改善特应性皮炎
期刊：Gut Microbes
IF：10.245
发表时间：2022.03.03
通讯作者：陆文伟
通讯作者单位：江南大学食品学院
DOI号：10.1080/19490976.2022.2044723
实验设计
选择6周龄雌性C57BL/6小鼠（SPF级）为试验材料，利用2,4-二硝基氟苯（DNFB）诱导构建AD模型。小鼠随机分为对照组、DNFB组、I3C组、CCFM1029组和AHR拮抗剂CH223191组（n = 8）。采集小鼠粪便样本进行宏基因组测序分析。招募AD患者进行随机的安慰剂对照试验，所有受试者（n = 102）随机分为安慰剂组和CCFM1029组，统计患者的基线临床特征。采集受试者血清和粪便样品，进行16s rRNA扩增子测序和吲哚衍生物的测定。同时进行长双歧杆菌色氨酸代谢产生吲哚衍生物的体外测定。探究长双歧杆菌介导色氨酸代谢如何通过肠-皮轴来改善特应性皮炎
本研究的流程图；HE：苏木精一伊红染色；KYN：犬尿氨酸（原文图6）。
结果
1 长双歧杆菌CCFM1029处理上调特应性皮炎（AD）小鼠肠道微生物群落的色氨酸代谢
使用2,4-二硝基氟苯（DNFB）诱导AD样小鼠模型，具体方法和步骤参见动物模型构建部分（材料和方法）。为了进一步探索长双歧杆菌菌株缓解AD的机制，我们选择了抑制异常Th2型反应的双歧杆菌优化菌株。死亡的长双歧杆菌CCFM1029并未出现小鼠AD样症状的缓解以及Th2型免疫反应的抑制（图S1）。死亡的长双歧杆菌CCFM1029没有显著降低AD样小鼠的病理评分和耳朵厚度。此外，虽然显著增加了IL-10和IFN-γ的表达，但不能显著影响IgE、调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg）比例和IL-4。这表明长双歧杆菌CCFM1029对AD的缓解作用与其代谢和/或与肠道微生物的相互作用有关。因此，我们使用鸟枪宏基因组测序（n = 4-5）分析了对照组、DNFB处理和活长双歧杆菌CCFM1029处理组小鼠肠道微生物的变化。PCoA揭示了不同处理小鼠之间肠道微生物组成的相似或不同（图1a）。根据PC1（23.93%）和PC2（15.79%）影响因素，将三组小鼠分为不同的聚类，这表明了小鼠肠道微生物群的差异。放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门是三组中的优势菌（图1b）。与对照组相比，DNFB组的放线菌门（9.13%）增加，但厚壁菌门（49.60%）减少（放线菌门和厚壁菌门分别为5.79% 和51.57%）。与DNFB组相比，长双歧杆菌CCFM1029处理增加了放线菌门（11.84%）和厚壁菌门（50.13%）的相对丰富度，但拟杆菌门（32.13%）丰富度减少。变形菌门在三组中没有显著变化，但Candidatus_Saccaribacteria在DNFB组中显著减少。在属水平上（相对丰富度> 0.5%），与对照组相比，DNFB组中普氏菌属，未分类的厚壁菌门，未分类的Bacilli Enterohabdus纲，另枝菌属，链球菌属，Eggerthella，肠球菌属，Adlercreutzia丰富度增加，而未分类的毛螺旋菌科，乳酸菌属，葡萄球菌属，梭菌属和未分类的Candidatus Saccharibacteria门则降低（图1c）。与DNFB组相比，长双歧杆菌CCFM1029处理增加了乳酸杆菌属、未分类毛螺旋菌科、未分类的Candidatus Saccharibacteria门、肠杆菌属、梭菌属和葡萄球菌属的丰富度，减少了未分类的厚壁菌门、拟杆菌属、普氏菌属、链球菌属和肠球菌属。
为了分析DNFB和CCFM1029+DNFB（CCFM1029，下同）组之间肠道微生物基因功能的差异，进行了线性判别分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）（LDA值log10 >2，图1d）。在DNFB组中，氨基酸生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、C5 -二元酸代谢、安莎霉素生物合成、阿卡波糖和庆大霉素生物合成、万古霉素类抗生素的生物合成途径均高于CCFM1029组。相比之下，CCFM1029组的氨基酰tRNA生物合成、同源重组、军团菌病和色氨酸代谢（p < 0.05，图1d，右）更高。进一步通过UHPLC Q-Exactive Plus MS分析粪便色氨酸代谢产物。与对照组相比，DNFB组色氨酸代谢中间产物犬尿氨酸（KYN）增加，但吲哚衍生物减少（图1e）。与DNFB组相比，长双歧杆菌CCFM1029处理显著增加粪便中I3C，但不增加其他吲哚衍生物。结果表明，长双歧杆菌CCFM1029通过色氨酸代谢途径重塑肠道微生物组成，显著上调了I3C。
图1. 长双歧杆菌CCFM1029对小鼠肠道微生物组成和色氨酸代谢的影响。（a）肠道微生物组的主坐标分析；（b）在门水平上的肠道微生物组成；（c）在属水平上的肠道菌微生物的变化；（d）基于KEGG途径的肠道微生物群的基因功能改变；（e）粪便样本中色氨酸代谢物的变化；KEGG，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；DNFB，2,4-二硝基氟苯；CCFM1029，长双歧杆菌CCFM1029；KYN：犬尿氨酸；IA：吲哚-3-丙烯酸；IAA：吲哚乙酸；ILA：吲哚-3-乳酸；IPA：吲哚-3-丙酸；I3C：吲哚-3-甲醛。
2 色氨酸代谢产生的I3C增加与长双歧杆菌 CCFM1029代谢密切相关
为了探究CCFM1029组小鼠粪便I3C升高的来源，我们对肠道菌群色氨酸代谢进行了贡献分析。在三个处理中，Akkermansia muciniphila、Alistipes shahii、Bacteroides thetaiotaomicron、Burkholderia cenocepacia、Enterorhabdus caecimuris、Ralstonia solanacearum均有助于肠道微生物色氨酸代谢，但仅在CCFM1029组中检测到长双歧杆菌（图2a）。此外，在 CCFM1029 组中，Enterorhabdus caecimuris 和长双歧杆菌 的相对丰度增加，但其他细菌减少（图 2b）。此外，在 CCFM1029 组中，Enterorhabdus caecimuris和长双歧杆菌的相对丰度增加，但其它细菌减少（图2b）。基于相关性分析，粪便I3C水平与长双歧杆菌呈正相关（p < 0.05）（图2c）。而，I3C与Enterorhabdus caecimuris之间的相关性较弱。对色氨酸代谢有贡献的肠道细菌之间有复杂的相互作用，例如，Akkermansia muciniphila与Bacteroides thetaiotaomicron呈正相关关系（p < 0.05），而与长双歧杆菌呈负相关关系。为了评价长双歧杆菌CCFM1029代谢色氨酸的能力，我们采用体外静息细胞培养系统测定了长双歧杆菌CCFM1029的吲哚衍生物。长双歧杆菌CCFM1029（8.5 × 108 CFU/mL）代谢色氨酸产生ILA（16967.43±1257.53 ng/mL）、IAA（3.89±1.78 ng/mL）和I3C（11.20±0.64 ng/mL），但无法检测到IPA和IAA的产生（图2d，图S2）。此外，根据前期的研究结果，我们随机挑选了一些无效的长双歧杆菌菌株，分析其体外产I3C的能力。与长双歧杆菌CCFM1029相比，这些菌株产生I3C的能力较低（图2e）。这些结果表明，长双歧杆菌CCFM1029通过色氨酸代谢产生I3C，具有在肠道内催化膳食色氨酸的潜能。
图2. I3C 来源于长双歧杆菌 CCFM1029 分解代谢色氨酸。（a-b）肠道微生物对色氨酸代谢的贡献分析；（c）肠道微生物改变与I3C变化的相关性分析；（d）评价长双歧杆菌CCFM1029在体外的代谢色氨酸；（e）体外长双歧杆菌菌株代谢色氨酸生产I3C的比较；*** P < 0.001, **** P < 0.0001 vsCCFM1029组（单向方差分析）。
3 长双歧杆菌CCFM1029诱导的I3C激活AHR抑制Th2型免疫反应
AHR信号传导有助于抑制TSLP 基因表达并抑制AD中的异常Th2型免疫反应。因此，我们假设长双歧杆菌CCFM1029通过AHR介导的信号通路缓解AD症状。CH223191是AHR的拮抗剂，用于阻断AHR。苏木精-伊红染色显示，与对照组相比，DNFB组背部皮肤的炎症浸润增加（图 3a）。与DNFB组相比，长双歧杆菌CCFM1029组与阳性药物对照I3C一样，显著缓解了背部肿胀，但CH223191处理消除了长双歧杆菌CCFM1029的缓解作用。与DNFB处理相比，长双歧杆菌CCFM1029和I3C处理显著降低了小鼠耳朵厚度和血清 IgE（图 3b，c）。为了研究AHR激活对长双歧杆菌CCFM1029诱导的临床表现的影响，我们评估了AHR的表达情况。长双歧杆菌CCFM1029和I3C处理显著增加AHR的表达，但CH223191处理显著阻断AHR的激活（图3d）。此外，在下游通路评估了TLSP和Th2相关细胞因子的表达。与DNFB组相比，长双歧杆菌CCFM1029处理显著降低TSLP的表达，从而抑制通过AHR激活IL-4和IL-5的表达（图 3e-g）。为了探索AHR的激活是否与I3C相关，我们测定了血清I3C、ILA和IAA水平。CCFM1029组与DNFB组相比I3C水平显著增加（图3h），但血清ILA和IAA在两组之间没有显著差异（图S3）。结果表明，长双歧杆菌CCFM1029通过产生I3C激活AHR信号通路来缓解AD临床症状。
图3. 长双歧杆菌CCFM1029通过AHR介导的免疫反应缓解AD症状。（ a ）长双歧杆菌CCFM1029对皮肤炎症的影响；（b）小鼠耳朵厚度的改变；（ c ）血清IgE （*** p < 0. 001，**** p < 0. 0001）的变化；（ D ） AHR 表达的倍数变化；（ e-g ） 皮肤损伤中的 TSLP、IL-4 和 IL-5的表达情况；（ h ）长双歧杆菌 CCFM1029对血清I3C的影响；* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001vs DNFB组（单因素方差分析）；AHR，芳基烃受体；TSLP、胸腺基质淋巴细胞生成素。
4 长双歧杆菌CCFM1029治疗增加I3C水平缓解患者AD症状
招募患者并将符合条件的受试者随机分配到安慰剂组（n = 43）和 CCFM1029 组（n = 44）（图 4a）。安慰剂组和CCFM1029组之间的基线临床特征没有显著差异（表1）。经过8周的治疗后，长双歧杆菌CCFM1029与干预前相比显著降低了特应性皮炎评分指数（scoring atopic dermatitis index，SCORAD）和皮肤病生活质量指数（dermatology life quality index，DLQI）指标，但安慰剂没有显著影响（图 4b）。此外，与干预前和安慰剂治疗后相比，长双歧杆菌CCFM1029治疗显著降低了IgE水平，但不能显著降低Th2型细胞因子（图 4c，图 S4）。尽管与干预前相比，长双歧杆菌CCFM1029并未降低IL-4，但与安慰剂治疗后相比，它降低了血清IL-4水平（p = 0.078）。为了分析长双歧杆菌CCFM1029 对吲哚衍生物的影响，在粪便和血清样本中测定了它们的变化情况。在无反应亚组中（NR，CCFM1029治疗后SCORAD没有降低，n = 12），与长双歧杆菌CCFM1029干预前相比，它对粪便和血清样品中的六种吲哚衍生物没有显著影响（NR-B，图4d）。在具有响应亚组（R，CCFM1029治疗后SCORAD降低，n = 31）中，与干预前（R-B）相比，长双歧杆菌CCFM1029显著增加血清ILA、血清I3C和粪便I3C水平。此外，基于相关性分析，I3C与 SCORAD和DLQI呈负相关（p < 0.05，图 4e），但ILA与它们没有显著的负相关关系。患者I3C的变化与上述动物试验的结果一致。这些结果表明，长双歧杆菌CCFM1029通过增加I3C来缓解患者的AD症状。
表1. 患者的临床基线特征
图4. 长双歧杆菌CCFM1029对AD患者的影响。（a）安慰剂组和CCFM1029组患者的流程图；（b）长双歧杆菌CCFM1029对SCORAD和DLQI指标的影响；（c）长双歧杆菌对血清标志物的影响；（d）长双歧杆菌CCFM1029对粪便和血清样品中吲哚衍生物的影响，* p < 0.05；SCORAD，特应性皮炎评分指数；DLQI，皮肤科生活质量指数；NR-B，无反应亚组（CCFM1029治疗前）；NR，无反应亚组（CCFM1029 治疗后）；R-B，反应亚组（CCFM1029 治疗前）；R，反应亚组（CCFM1029 治疗后）。
5 长双歧杆菌CCFM1029重塑了肠道微生物组成，上调了与肠道微生物色氨酸代谢相关的功能基因
安慰剂和长双歧杆菌CCFM1029不影响肠道微生物的Shannon多样性指数（图S5）。NMDS分析表明，长双歧杆菌CCFM1029（而非安慰剂）显著改变了患者肠道微生物的β多样性（p < 0.004，图 5a，图 S5）。在门水平上，安慰剂降低了放线菌和变形菌的比例并增加了厚壁菌（图 5b）。与长双歧杆菌CCFM1029干预之前（CCFM1029-B）相比，NR亚组中拟杆菌门的比例增加，但变形菌门和放线菌门减少（图5c）。然而，R亚组中变形菌门的丰度降低，但放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门增加。在属水平上（相对丰富度 >0.5%），LEfSe分析显示安慰剂处理后的考拉杆菌属和酸氨基球菌科丰度更高（图 5d）。安慰剂治疗8周降低了患者放线菌门、厚壁菌门和变形菌门的比例，其中包括不动杆菌属、双岐杆菌属、克雷伯氏菌属、嗜血杆菌属、肠杆菌属、魏斯氏菌属和柯林氏菌属。然而，与CCFM1029-B和NR相比，毛螺旋菌属和萨特氏菌属是R亚组中的差异分类群（图 5e）。NR亚组中萨特氏菌属的相对丰度显著增加，但与长双歧杆菌CCFM1029 治疗前相比，R亚组对其没有显著影响。此外，与CCFM1029-B组相比，NR亚组中毛螺菌科的比例显著降低，但在R亚组中保持不变（图5f）。基于PICRUSt基因功能分析，长双歧杆菌CCFM1029治疗显著上调了与肠道微生物中的色氨酸代谢相关的887功能基因的丰度（图5g），这与AD患者粪便和血清样本中I3C的增加一致。结果表明，长双歧杆菌CCFM1029治疗可调节肠道微生物组成，并有助于增加AD患者肠道微生物的色氨酸代谢。
图5. 长双歧杆菌CCFM1029对患者肠道微生物的影响。（a）肠道微生物群β多样性的NMDS分析；（b-c）在门水平上患者的肠道微生物变化；（d）安慰剂干预前后差异分类群的LEfSe分析（p < 0.05，LDA值log10> 2.0）；（e）CCFM1029-B组、NR亚组和R亚组中差异分类群的分支图；（f）毛螺旋菌属和萨特氏菌属比例的变化；（g）与色氨酸代谢相关的功能基因的丰度；* p < 0.05 vs CCFM1029-B，**** p < 0.0001。
讨论
本文通过体外和体内试验，探究了长双歧杆菌CCFM1029改善临床症状的机制和有效的代谢产物，揭示了长双歧杆菌CCFM1029通过肠道-皮肤轴对免疫调节的影响。在一项临床试验中，鼠李糖乳杆菌IDCC3201治疗12周可显著降低中度AD患者SCORAD，显示出巨大的AD治疗潜力。结果表明，死亡的益生菌可能通过细胞壁的成分改善疾病的临床症状。与DNFB组相比，死亡的长双歧杆菌CCFM1029不能降低皮肤病理评分和炎症浸润（图S1）。长双歧杆菌CCFM1029自身的组成成分不能抑制小鼠Th2型反应，改善AD样症状。因此，这些结果表明长双歧杆菌CCFM1029的缓解作用与其自身代谢产物或与肠道微生物的相互作用有关。
长双歧杆菌CCFM1029在动物和临床实验中可以上调色氨酸代谢（图 1d，图5g）。色氨酸代谢是肿瘤和神经退行性疾病中通过犬尿氨酸代谢途径、5 -羟基色氨酸代谢途径和微生物代谢途径的治疗靶点。吲哚和吲哚衍生物是色氨酸的微生物代谢产物。长双歧杆菌仅在CCFM1029组中检测到，且与I3C水平呈正相关（图2a-c ）。尽管许多细菌促成了肠道中色氨酸的代谢，但根据测序数据，粪便样本中的一些物种是未知的。此外，基于HUMAnN2（The HMP Unified Metabolic Analysis Network 2）分析，一些注释物种的核苷酸水平或蛋白质水平未映射到有关色氨酸代谢的途径。因此，图2a中还有未分类的物种有助于色氨酸代谢，它们的功能在未来的研究中有待阐明。此外，与无效的长双歧杆菌菌株M611、Y6M1、X1M6 和23M3 相比，长双歧杆菌CCFM1029在体外试验中将色氨酸转化为更多的I3C（图 2d，e）。与动物试验和体外试验结果一致，长双歧杆菌CCFM1029可以通过提高患者粪便和血清I3C水平显著改善AD症状（图4d）。尽管与RB亚组相比，R亚组的ILA显著升高，但 I3C 对 AHR 的敏感性远高于 ILA。根据相关性分析，I3C与SCORAD和DLQI呈显著负相关（图4e），因此I3C可能是改善AD的有效代谢物。这些结果表明，长双歧杆菌CCFM1029产生的I3C有助于改善 AD 症状。
大多数吲哚衍生物如ILA、IAA和I3C，都是AHR的内源性配体，而AHR信号介导的免疫反应有助于AD的治疗。多环芳烃混合物可以改善AD依赖的AHR激活，通过STAT6去磷酸化干扰Th2信号通路。AHR拮抗剂CH223191消除了长双歧杆菌CCFM1029对AD的缓解作用（图 3），这表明长双歧杆菌CCFM1029诱导的皮肤炎症减少需要AHR的激活。这与先前的发现一致，AHR的激活抑制了TSLP的表达，从而减少了AD小鼠的异常Th2反应。然而，长双歧杆菌 CCFM1029显著降低血清IgE，但对患者的TSLP和Th2反应没有显著的影响（图 3c）。口服益生菌12周对AD患者的血液标志物IL-4、IL-5和IL-13没有显著影响，这与我们的研究结果一致。口服热灭活L. plantarum 0132 发酵汁8周可缓解中度AD患者的症状，并显著降低IgE、特异性IgE和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）等血液标志物水平。这些有争议的结果表明益生菌菌株对免疫反应的影响具有特异性。
肠道微生物的远程影响在哮喘、抑郁症等疾病中得到验证。肠道微生物组成和功能的改变与皮肤病的免疫反应有关，这为AD的发生提供了一定的见解。长双歧杆菌CCFM1029改变了肠道微生物的β多样性并调节了肠道微生物组成（图 5a）。在一项AD患者的临床试验中，肠道微生物β多样性的改变是显著的，而α多样性没有显著改变，这与我们的研究结果一致。长双歧杆菌CCFM1029降低了属于变形菌门的Escherichia-Shigella和克雷伯氏菌属的比例。变形菌门的高比例可能与AD的发生有关。有研究表明，在爱沙尼亚和瑞典的过敏儿童中，含有较高的Escherichia-Shigella和葡萄球菌属。与对照组相比，向孕妇补充双歧杆菌可显著降低特应性皮炎/湿疹的风险，并且变形杆菌的比例较低。在动物试验中，长双歧杆菌CCFM1029显著提高了乳酸杆菌属、梭菌属和未分类的毛螺旋菌科的丰富度（图 1c）。β-葡聚糖和L. plantarum LM1004处理通过增加AD小鼠的毛螺旋菌属、拟杆菌属和罗斯氏菌属来降低Th2和Th17细胞转录因子的表达。增加的乳酸菌可能有助于产生γ-氨基丁酸（GABA），从而抑制皮肤瘙痒。在一项关于儿童早期AD自然过程的研究中，在持续性AD的儿童中检测到高比例的链球菌属和低梭菌属和阿克曼菌属。
考拉杆菌属是安慰剂组中差异微生物（图5d），与帕金森病和代谢综合征的发生有关。与CCFM1029-B 组相比，NR亚组中萨特氏菌属增加，但毛螺旋菌科减少。萨特氏菌属与胃肠道疾病和精神疾病的发生和发展密切相关，例如炎症性肠病、溃疡性结肠炎和自闭症。毛螺旋菌科是一种产生SCFA的细菌，在一项纵向研究中，SCFA的延迟积累与婴儿过敏性AD的发生风险密切相关。此外，含有丙酸和I3C等下游代谢产物的毛螺旋菌科对遭受辐射的小鼠具有保护作用。长双歧杆菌CCFM1029治疗维持了R亚组相对于CCFM1029 - B组毛螺旋菌科的比例。这说明肠道菌群可能参与了I3C的产生，但如果没有长双歧杆菌CCFM1029治疗，还不足以发挥对AD的缓解作用。因此，长双歧杆菌CCFM1029治疗重塑了AD患者肠道微生物组成，促进了色氨酸代谢的增加（图5g）。在本研究中，我们不排除肠道微生物群在原位对色氨酸代谢的贡献，这本研究的一个局限。在未来的研究中，将通过无菌小鼠模型探索吲哚衍生物的影响，以评估肠道微生物群对色氨酸代谢的影响。综上所述，我们的结果表明，通过影响长双歧杆菌CCFM1029产生的I3C触发肠道和皮肤之间的相互作用，可以缓解AD症状。此外，吲哚衍生物，色氨酸的肠道微生物代谢物，可以通过信号分子的作用影响宿主的免疫调节，并可能成为改善过敏性疾病的有效靶点。